Sådan udfører du et gramfarvning

Gramfarvning er en hurtig fremgangsmåde anvendt til at identificere forekomsten af bakterier i vævsprøver og til at karakterisere bakterier som Gram-positiv eller Gram-negativ baseret på cellemonternes kemiske og fysiske egenskaber. Denne farve bør næsten altid ske som et første skridt i diagnosen af en bakteriel infektion.

indhold

Trin

Del 1klargøring af bladet
Del 2gør gram plet
Del 3undersøgelse af resultatet

Tips
Advarsler
Nødvendige materialer
Kilder og citater

Proceduren blev opkaldt efter den danske videnskabsmand Hans Christian Gram (1853 - 1938), som udviklede teknikken i 1882 og offentliggjort i 1884 som en proces til at skelne mellem to typer af bakterier med lignende kliniske symptomer: Streptococcus pneumoniae (også kendt som pneumokokker) og Klebsiella pneumoniae.

trin

Del 1
Klargøring af bladet

Gør dig klar til arbejde i laboratoriet. Sæt på handsker og binde det lange hår tilbage for at undgå at forurene prøven, der skal testes. Desinficer et arbejdsområde under den kemiske hætte eller et andet godt ventileret område og se om Bunsen-dysen og mikroskopet virker, før du starter.

Steriliser en glasskinne til et mikroskop. Hvis bladet er snavset, vask det med sæbe og vand for at fjerne fedt og snavs. Desinficer det med ethanol, en glasrenser eller den metode, som anbefales af dit laboratorium.

Sæt prøven på diaset. Du kan bruge Gramfarvningsmetoden til at identificere bakterier til stede i medicinske prøver eller bakteriekulturer dyrket på en petriskål. For at metoden skal være nyttig, læg et lag tynd af prøven i farvningen. Det anbefales at bruge en prøve mindre end 24 timer gammel, da de ældre bakterier kan have beskadigede cellevægge, som vil reagere mindre forudsigeligt for processen.

Hvis du bruger en vævsprøve, skal du placere en til to dråber på diaset og spredes jævnt for at danne et tyndt punkt ved hjælp af et andet steriliseret glasglas. Lad lufttørre, før du fortsætter.
Hvis du bruger bakterier fra en petriskål, steriliseres en inokuleringssløjfe til en Bunsen-tud, indtil den skinner og derefter afkøles. Brug det til at placere en dråbe destilleret vand på bladet og steriliser derefter og tørre sløjfen igen, inden du overfører en lille prøve af bakterier og bland det forsigtigt i vandet.
Bakterierne i bouillonblandingen blandes i en omrører og tilsættes derefter med en inokuleringssløjfe som ovenfor uden tilsætning af mere vand.
Hvis du har en vatpindprøve, rulles vatpinden forsigtigt gennem bladet.

Fix pletten ved hjælp af varme. Varmen vil sætte bakterierne på lysbilledet, så de ikke let kan vaskes under farvning. Før bladet to eller tre gange hurtigt igennem en Bunsen-brænders flamme eller varm den over en elektrisk knivvarmer. Overdrive det ikke, eller du kan forvride prøverne. Ved brug af en Bunsen-dyse skal flammen være en lille, blå kegle, ikke en høj orange flamme.

Alternativt kan pletten fastgøres ved tilsætning af en til to dråber methanol i det tørre punkt, fjernelse af det overskydende produkt og tilladelse til at lufttørre. Denne metode minimerer skade på værtsceller, hvilket giver en renere baggrund.

Placer bladet i en farvebakke. Den består af en lav plade af metal, glas eller plastik med en lille skærmholder eller wire over toppen. Placer bladet på denne holder, så de væsker du bruger kan dræne i bakken.

Hvis du ikke har en farveskuffe, kan bladet placeres direkte på en form af plastis.

Del 2
Gør Gram plet

Soak pletten med gentian violet. Brug en pipette til at suge bakterieprøven med flere dråber gentian violet, nogle gange kaldet krystalviolet eller methyl violet. Vent 30 til 60 sekunder. Gentian violet dissocierer i vandige opløsninger, der danner CV + og Cl (Cl-). Disse ioner trænger ind i væggen og membranen af gram-positive og gram-negative celler. CV + ion interagerer med de negative ladningskomponenter af bakterieceller for at farve dem i lilla.

Mange laboratorier bruger gentian violet med ammoniumoxalat for at forhindre nedbør.

Skyl gentian violet forsigtigt. Vip bladet og brug en sprøjte til at smide lidt vand eller destilleret vand over bladet. Vandet skal passere gennem overfladen af pletten, men må ikke smides direkte over det. Skyl ikke for meget af for at fjerne farvning af Gram-positive bakterier.

Sug pletten med jod og skyl. Brug en pipette til at dække stedet med jod og lad det fungere i mindst 60 sekunder. Skyl derefter med samme metode omhyggeligt. Iodet i form af negativt ladede ioner, vekselvirker med VC + for at danne store komplekser af ensianviolet og iod (CV-I-komplekser) inden for de indre og ydre lag af cellen, falder violet hvor det er.

Jod er ætsende. Undgå indånding, indtagelse eller hudkontakt.

Tilsæt en blegemiddel og skyll hurtigt. En 1 til 1 blanding af acetone og ethanol anvendes sædvanligvis til dette kritiske trin, som bør tages omhyggeligt. Hold det skrånende blad og tilføj affarvningsværktøjet, indtil violet ikke længere er synligt i den ekspanderende væske. Processen tager normalt 10 sekunder eller mindre, hvis decoloranten indeholder højere koncentrationer af acetone. Stop straks, eller blegemiddelet fjerner gentian violet plet fra de positive og negative celler, hvilket får testen til at gentages. Skyl straks ved anvendelse af kendt teknik.

Ren acetone (> 95%) kan anvendes i stedet for blandingen. Jo mere acetone, jo hurtigere vil blegemiddelet virke, hvilket kræver mere præcis styring af tiden.
Hvis du har problemer med at indstille tidspunktet for dette trin, skal du overveje at tilføje blegemiddelet drop-by-drop.

Soak pletten med en kontrastfarve og skylle. Kontrasten farvestof, som regel safranin eller fuchsin, der bruges til at tilføje en ekstra kontrast mellem Gram-positive og Gram-negative farvning misfarvet (Gram negativ) af pink eller rød. Lad være i mindst 45 minutter og skyl.

Fuchsin vil plette mange gram-negative bakterier, såsom haemophilus spp og legionella spp, så det er en bedre mulighed for begyndere.

Tør bladet. Du kan lade det tørre i vinden eller trykke på den ved at bruge blottpapir, der sælges til det formål. Gramfarvning sluttede.

Del 3
Undersøgelse af resultatet

Forbered det optiske mikroskop. Placer bladet under mikroskopet. Bakterier kan variere meget i størrelse, så den samlede forstørrelse, der er nødvendig, kan variere fra 400x til 1000x. Ved højere forstørrelsesværdier anbefales det at bruge en objektiv objektiv nedsænket i olie for klarhed. Sæt en dråbe dippingolie på bladet, så du undgår at lave for mange bevægelser under applikationen for at forhindre blærer. Flyt revolveren fra mikroskopet, så objektivlinsen låser på plads ved at røre ved olien.

Immersion i olie kan kun bruges på specielle linser, ikke "tørre" linser.

Identificer gram-positive og gram-negative bakterier. Undersøg diaset under mikroskopet - Gram-positive bakterier vil være lilla på grund af gentian violet fanget i dens tykke cellevægge. Gram-negativet vil være rødt eller lyserødt, da violet er blevet vasket gennem de tynde cellevægge, og så er den lyserøde kontrastfarve kommet ind gennem dem.

Hvis prøven er for tyk, kan du se falske positiver. Hvis alle typer bakterier er Gram-positive, gentages testen med en anden prøve for at bekræfte resultatet.
Hvis affarvningsanordningen virker for lang, kan du se falske negativer. Hvis alle typer bakterier er gram-negative, gentages testen med en anden prøve for at bekræfte resultatet.

Se efter reference billeder. Hvis du ikke er sikker på forekomsten af en bakterie, skal du se en samling af referencebilleder, der er arrangeret af formatet og resultatet af Gram-farvning. Du kan finde online database på American Database of Microbial Pathogener, på Bakterier i billeder og mange andre steder. For at gøre identifikationen nemmere, opregner vi nedenstående almindelige eller vigtige eksempler på diagnostik efter status og format.

Identificer gram-positive bakterier efter formatet. Bakterier klassificeres efter deres format under mikroskopet, mere almindeligt som cocci (sfæriske) eller baciller (cylindrisk). Her er nogle fælles gram-positive bakterier organiseret af formatet:

den Gram-positive cocci de er normalt stafylokokker (kokoner i bunker) eller streptokokker (kokosnøtter).
den Gram-positive baciller De omfatter Bacillus, Clostridium, Corynebacterium og Listeria. Bacillerne Actinomyces spp. har ofte filialer eller filamenter.

Identificer gramnegative bakterier. Gram-negativet (lyserød) klassificeres ofte i tre grupper: kokkerne er sfæriske, bacillerne er lange og tynde, og cocoidbacillerne er i midten.

den Gram-negative cocci er mest almindeligt Neisseria spp.
den Gram-negative baciller De omfatter E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas og mange andre. Bakterierne Vibrio cholerae kan ligne almindelige eller buede baciller.
den Gram-negative coccoid baciller (eller "coccobacilli") De omfatter Bordetella, Brucella, Haemophilus og Pasteurella.

Vurdere blandede resultater. Nogle bakterier er vanskelige at farve præcist på grund af det skrøbelige eller voksagtige udseende af cellevægge. De kan have en blanding af lilla eller rosa farvning i samme celle eller mellem forskellige celler i samme prøve. Enhver prøve af bakterier længere end 24 timer kan have dette problem, men nogle arter er svære at farve i en hvilken som helst alder og kræver mere specialiserede tests for at reducere identifikation, såsom Ziehl-Neelsen-teknikken, observation af afgrødevækst, TSI agar eller den genetiske test.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium og Propionibacterium spp. betragtes alle som Gram-positive bakterier, men kan ofte ikke give afgjørende resultater i denne test.
Små og fine bakterier som Treponema, Klamydia og Rickettsia spp. er vanskelige at farve korrekt ved hjælp af denne teknik.

Slippe af med materialer Affaldsbehandlingsprocedurer varierer afhængigt af det anvendte laboratorium og materialer. I almindelighed kasseres væsken fra farvingsbakken i forseglede flasker som farligt affald. Dyp gliderne i en 10% blegemiddelopløsning og kassér dem i beholdere til bortskaffelse af skarpe materialer.

tips

Husk at resultatet af Gram-farvning er så godt som prøven. Det er vigtigt at lære patienter at give gode prøver ved at vise for eksempel forskellen mellem en spyt og et dybere slim i sputumprøver.
Som blegemiddel virker ethanol langsommere end acetone.
Følg standard laboratorieforanstaltninger.
Brug en kindprøveprøve til at praktisere, da den skal indeholde gram-positive og gramnegative bakterier. Hvis du kun ser en type eller den anden, bruger du sandsynligvis for meget blegemiddel eller for lidt.
Du kan bruge en fjederbelastet træ tøj prædiker til at afhente bladet.

advarsler

Aceton og ethanol er brændbare, og den første vil fjerne olierne fra din hånd, hvilket gør huden mere absorberende af andre kemikalier. Så brug handsker og pas på.
Lad ikke prøven tørre, før du skylder pletten eller modfladen.